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引物二聚体形成原因?pcr产物放置一段时间后引物二聚体变多?( 四 )


Mg2+浓度　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜 。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少 。
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数 。
温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点 。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸 。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性) 。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因 。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响 。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败 。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合 。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞 。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度 。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想 。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
　复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合 。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
　70℃ 60核苷酸/S/酶分子
　55℃ 24核苷酸/S/酶分子
　高于90℃时，DNA合成几乎不能进行 。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合 。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的 。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min 。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现 。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些 。
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